腦水腫的誘因水通道蛋白活性改變

作者:见文 來源:战支医学中心医学科普_wtg1 2019-11-01 10:42:08 0 0

原标题:脑水肿的诱因水通道蛋白活性改变

张俊海,解放军306医院,神经外科

水通道蛋白与脑水肿

水通道蛋白(Aquaporin),又名水孔蛋白,是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白),在细胞膜上组成“孔道”,可控制水在细胞的进出,就像是“细胞的水泵”一样。

水通道是由约翰霍普金斯大学医学院的美国科学家彼得·阿格雷所发现,他与通过X射线晶体学技术确认钾离子通道结构的洛克斐勒大学霍华休斯医学研究中心的罗德里克·麦金农共同荣获了2003年诺贝尔化学奖。

水分子经过Aquaporin时会形成单一纵列,进入弯曲狭窄的通道内,内部的偶极力与极性会帮助水分子旋转,以适当角度穿越狭窄的通道,因此Aquaporin的蛋白构形为仅能使水分子通过之原因。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一种水的分子通道,在动物和植物细胞中已经发现有多种不同的水通道蛋白。由于水通道蛋白的存在,细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压,水通道蛋白对于生命活动至关重要。

一、AQP的发现与家族种类

过去认为, 水在细胞内外的转运只是通过脂质双分子层扩散来完成。但在某些生理现象中, 如红细胞、肾近曲小管上皮细胞等对水的转运速度非常快, 不能用水简单扩散来解释。Agre等(1988) 在鉴定人类Rh 血型抗原时,偶然在红细胞膜上发现一种新的28KD 的疏水性跨膜蛋白,称为形成通道的整合膜蛋白28 (CHIP) ,1991 年完成其cDNA 克隆,但当时并不知道该蛋白的功能。在进行功能鉴定时,将体外转录合成的CHIP28 cDNA 注入非洲爪蟾的卵母细胞中,发现在低渗溶液中,卵母细胞迅速膨胀,并于5min 内破裂。为进一步确定其功能,又将其构建于蛋白磷脂体内,通过活化能及渗透系数的测定以及后来的抑制剂敏感性等研究,证实其为水通道蛋白。从此确定了细胞 膜上存在转运水的特异性通道蛋白,并称CHIP28 为AQP1 。以后又陆续从哺乳动物组织中鉴定出9 种水通道蛋白(AQP2 ~AQP10 ) ,它们与先前克隆的晶体纤维中的主要内源性蛋白(majorintrinsic protein ,MIP) 有20 %~40 %的氨基酸序列同源性,目前所发现的水通道均属MIP家族,后经证明MIP 亦有弱的水通道活性,被命名为AQP0。

这些相继发现的专一性运输水的通道蛋白被统称为AQPs。AQP家族,存在于不同的组织器官中, 如:AQP2 存在于肾髓和肾皮质收集管主细胞, 它在调节水的排泄中有重要作用, 约有10% 的肾小球滤过液流经集合管时是在AQ P2 的参与下被重吸收的。AQP5大量存在于唾液腺和泪腺中, 与唾液和泪液的产生有关。AQP0在眼中有较高的表达, 被认为与晶状体的透明度有关。它们对于维持机体的水平衡起着重要作用,并且与水平衡紊乱所造成的一些疾病有密切关系。

AQPs除了跨膜转运水外, 近来发现还能通透其它小分子。Tsukaguchi 等据此将其分为三类: Ⅰ类为选择性水通道, 如AQP1、2、4、5;II类对某些中性溶质( 尿素、甘油) 有一定的选择通透性, 如AQP3、7等;Ⅲ类有广泛的选择通透性( 尿素、多元醇、乳酸盐、羧基丁酸、嘌呤、嘧啶等),如AQP9。后两类又称水甘油通(aquaglyceroporins)。新克隆出来的AQP10对水 和中性溶质具有渗透性,却不能渗透甘油和尿素。另一种分类方法就是根据AQPs 功能能否被汞抑制而分为汞敏感性蛋白和不敏感性蛋白。AQPs 家族的绝大多数成员都具有汞敏感性, 即汞制剂能够抑制其对水的通透性;而只有AQP4 和AQP7具有汞不敏感性。据研究AQP4 与AQP1 的组织构成性活性不同的是邻近NPA基序的半胱氨酸缺失,而汞离子和有机汞通过与AQP1残基C189形成硫醇键使其发生构象改变, 引起水通透性下降。近来研究又证实AQP1的70-73 和189残基定位于水孔或其附近,水孔的宽度也是可变的,而pCMBS(一种汞制剂)能通过71- 73残基而调节水通道的功能。

二、AQP4的结构

水通道蛋白(aquaporin,AQP)在脑水肿病理生理学机制中到了重要的作用。迄今已在脑内已发现6种AQP,别是 AQP1,3,4,5,8,9。AQP3、AQP5和AQP8的生理学功能未见报道外,AQP1主要在脉络丛内皮细胞表达,参与脑脊液生成;AQP9主要 存在于室管膜细胞以及下丘脑内侧基底部的室管膜细胞,可能调节中枢神经系统细胞外间隙与体循环之间的信号传递。AQP4 是脑内表达最多的AQP ,因此最可能与脑水肿形成和消除相关。

AQPs 所有成员之间的基因序列具有一定的同源性。AQP4 的基因定位在人染色体18q11.2 与q12.1 之间的连接处,由四个分别编码127、55、27、92位氨基酸的外显子组成, 并被0. 8、0. 3和5. 2kb 的内含子分隔开。AQ P4的一级结构同其它AQ P 一样, 为跨细胞膜6次的单肽链, 其氨基和羟基末端均位于细胞内, 含3个胞外环(A、C、E) 和2个胞内环(B、D)。AQ P4整个分子前后两部分在序列上相似, 呈180°定位的正面对称结构, 内部结构与其它AQ P 同源性最高的是位于B 环与E 环上的天冬酰氨- 脯氨酸- 丙氨酸(N PA ) 基序,NPA 基序重叠位于脂质双分子层之间, 产生一个使水分子单线通过的通道, 可使水分子顺渗透压梯度双向转运,这是AQ P 家族成员共有的特征性结构。 AQP4的四级结构是由具有活性、分子量约34kDa 亚单位组成的四聚体。四聚体在膜上的组装是维持AQP 的稳定和其正常功能所必须的 。AQP4 有3 个mRNA 亚型, 由N 端外显子的差异所决定。它们分别是AQP41M1 、AQP41M23 和AQP41M23X。AQP41M1 编码的蛋白为M1,AQP41M23 和AQP41M23X 编码的蛋白为M23 。M1 比M23 在N端多22 个氨基酸。亚型的表达存在组织和年龄的差异。

Ken - ichi等发现,AQP4 C端第276~280的5个氨基酸对于AQP4在细胞膜上的固定起着不可替代的作用,它们突变或缺失将导致AQP4不能固定于细胞膜上,影响生物学效应。 由于AQP4 在已知的汞结位点上缺乏半胱氨酸, 对汞的水通透抑制作用不敏感, 因而AQP4属于汞不敏感性水通道蛋白(Mercurial-insensitive waterchannel,MI2WC)。Amiry - Moghaddam等研究发现,AQP4位点特异性的锚定依赖于抗肌萎缩蛋白复合物(dystrophincomplex) ,其成员之一的α-syn是维持AQP4在血管周围膜极性分布所必需的蛋白复合物。

三、AQP4的分布与功能

AQP4 在机体的组织分布很广泛。在呼吸系统中,AQP4 分布于小呼吸道上皮细胞基底侧质膜,该部分呼吸道包括终末支气管和呼吸性支气管,在肺组织中,水通道蛋白在妊娠晚期胎儿开始表达,一直持续至成年,在研究 大鼠AQP4 mRNA 表达时,发现AQP4 在妊娠期胎儿仅有微弱的表达,但出生后表达迅速增强,出生后第2d mRNA水平增加8 倍,达最高峰。Yasui 发现,AQP4 出生后表达迅速增强,但持续时间短。AQP 表达水平的变化提示某些水通道可能参与出生早期肺内液体的快速转运,在这一时期,以AQP1 和AQP4 的作用尤为突出,这对于尽早恢复正常呼吸功能可能具有重要意义。

在消化系统,Huang等应用免疫定位技术发现AQP4蛋白定位在胃腺中部或深部的壁细胞上,而应用点杂交技术发现AQP4mRNA不能定位于 壁细胞而是在邻近的粘膜细胞,以及在胃底部的柱形细胞上,呈现蛋白与mRNA分离现象。这些细胞均与泌酸作用有关。在泌尿系统中,肾集合管(CD) 是尿液分泌最后的决定部位,AQP4 位于肾脏CD 上皮细胞基底侧质膜上,主要分布于外髓质内带及内髓质外1P3 的CD 中 ,在介导水通过肾脏CD 上皮细胞基底侧质膜转运上起重要作用,其功能不受血管加压素(AVP) 调节。Hoek 等研究AQP4 还表达于肾近端小管S3 段上皮细胞基底侧质膜,AQP4 的表达量可以反映尿液浓缩量和机制,缺少AQP4 的小鼠,尿浓缩功能明显下降。在运动系统中,AQP4 分布在快肌纤维细胞膜上,可能在细胞的收缩中起重要作用。在眼球中,眼球的液体转运是非常活跃的,AQP4 分布于睫状体非色素上皮细胞的基底膜、虹膜色素细胞、视网膜内颗粒层和外颗粒层及神经节细胞层 ,AQP4在视网膜血管的神经胶质细胞突起也有大量表达。

AQP4mRNA在脑内的表达含量高于眼,肾肺等器官10倍左右,是脑内主要的水通道蛋白。AQP4在侧脑室及导水管的室管膜细胞、脉络丛上 皮、软脑膜、下丘脑、视上核、视旁核、海马齿状回和小脑蒲肯野细胞均有明显表达。有研究者通过免疫细胞化学研究发现,AQP4蛋白主要表达于星形胶质细胞 和室管膜细胞, 尤其在与毛细血管和软脑膜直接接触的星型胶质细胞表达丰富, 这表明血管周围的星型胶质细胞突起和神经胶质界膜是水分子流动的主要部位。在神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞和脑膜成纤维细胞内未发现AQP4的表达。 但Venero等采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化和AQP4mRNA 的原位杂交双染发现,AQP4mRNA 在GFAP免疫阴性细胞中也有表达,认为神经元可能表达少量AQ P4。石向群等发现,AQP4主要分布于面向毛细血管内皮细胞、软脑膜和脑室室管膜侧胶质细胞的细胞膜或足突上,呈明显的极性现象,提示AQP4分布与脑 内水分转运具有同向性。高分辨胶体金免疫电泳显微镜观察证实,在朝向血管面及软膜面的胶质细胞膜区有选择性的AQP4高表达。这种分布特点提示AQP4在 维持大脑水平衡中起了重要作用,它是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要结构基础。

四、AQP4的表达与调节

Madrid 等认为AQP4 C 末端中两个独立的以酪氨酸、双亮氨酸为基础的基序决定靶向性、并通过酪蛋白激酶( casein kinase, CK) Ⅱ的磷酸化调节AQP4 的表面表达。PKC 及其激动剂Phorbol 12 , 132dibutyrate 和Phorbol 122myristate 132acetate 能够激活AQP4 的磷酸化,并呈剂量依赖性使其在爪蟾卵母细胞表达的水平下降 AQP4的B环含蛋白激酶A (p rotein kinase A , PKA)磷酸化同源序列,蛋白激酶C(p rotein kinase C , PKC)可通过蛋白磷酸化的方式调节AQP4活性。Yamamoto等对培养大鼠星形胶质细胞研究发现,培养液中加入十四烷酰佛波醋酸酯- 13 ( TPA ) ,导AQP4、AQP9 mRNA和蛋白水平的下调, PKC抑制剂阻断该作用,再给予TPA可消除AQP4和AQP9 mRNA表达的继续下降,使用放线菌酮预处理细胞,却不能阻断该作用,表明PKC 可在转录水平对AQP4 mRNA 进行调节。Zelenina 等推断PKC和多巴胺通过丝氨酸180 的磷酸化作用减小AQP4 对水的通透性。

星形胶质细胞中AQP4 的表达是细胞周期依赖的,仅表达于从神经干细胞开始分化为胶质细胞的初期和胶质细胞分化周期的G0/G1 期,而G0/ G1 期的AQP4 表达可能在脑水肿的修复中起了重要作用。

AQP4 在星形胶质细胞上的极化表达依赖于AQP4与抗肌营养不良蛋白( dystrophin)复合体之间的相互作用。Mdx小鼠由于缺乏抗肌营养不良蛋白复合体,星形胶质细胞足突上的AQP4表达显著减少。α- syntrophin基因敲除鼠的星形胶质细胞缺乏AQP4,而其他区域的表达不变或增多。

高渗性的甘露醇是临床上减轻脑水肿、降低颅内压最常用的药物。早期研究就发现甘露醇能够穿过大鼠正常的血脑屏障并浓集于细胞外间隙。 Hajime Arima 等通过体外细胞培养发现, 高渗性甘露醇可增加鼠星形胶质细胞AQ P4和AQ P9的表达; 体内实验表明, 动物腹腔注射甘露醇, 也能增加皮质AQ P4和AQ P9的表达。同时, 腹腔注射丝裂原活化蛋白激酶(p38MA PK) 的抑制剂可抑制AQ P4和AQ P9的表达, 而细胞外信号调节激酶(ERK) 抑制剂和c - Jun 氨基端激酶(JN K) 抑制剂对AQ P- 4和AQ P- 9的mRNA 和蛋白质的表达没有影响。

pH值也是影响AQP 家族表达的因素,尤其是当pH 降到5. 5 以后,AQP4 对乳酸盐和水表现出特殊的通透性,随着水的流出,AQP4 能促进对细胞外间隙乳酸盐的清除,使其进入胶质细胞。其他如M3 受体活性,多巴胺,碳酸酐酶抑制剂及高水平的血小板源生长因子,成纤维细胞生长因子等也影响着AQP4 的分布与表达,但具体机制仍不详。星形细胞里AQP4 和表达可能依赖于一种营养障碍基因的复合物,缺乏该复合物的mdx 小鼠,AQP4 在血管周围星形细胞足突的表达显著减少。培养的星形胶质细胞暴露于高浓度氨时可引起细胞肿胀,急性肝性脑病动物模型也存在星形胶质细胞肿胀。氨诱导星形胶 质细胞肿胀的机制尚不清楚,但有研究提示AQP4表达上调可能在此过程中起作用 ,可能与AQP4在碱性环境中的水通透性增加有关。

低氧的调节作用: AQP4 基因启动子区域有一低氧诱导因子结合基序。在培养的星形胶质细胞中,低氧可下调AQP4 mRNA 及蛋白的表达 ,重新给氧又可使AQP4水平恢复。在局灶性脑缺氧小鼠中,AQP4在梗死周围皮质表达增加 ;在人脑梗死时,梗死灶周围的AQP4免疫反应性也增加。从低氧到常氧的转变可诱导AQP4的转录。

另外, 温度、激素、生长因子、视黄酸等因素的变化都会对水通道产生影响, 而应用RNA 干扰( interference) 和转基因技术已成为研究AQP 的有力工具。

五、AQP4与脑水肿

根据脑水肿的发生机制不同,脑水肿可分为四种类型:细胞毒性脑水肿,血管源性脑水肿,间质性脑水肿和缺血性脑水肿。细胞毒性脑水肿,脑实质内的 水分增加主要与组织损伤和细胞渗透压调节障碍引起的渗透压梯度有关。血管源性脑水肿,与血管内皮损伤,血管通透性增高,水和血浆漏入周围脑组织引起的水 肿。间质性脑水肿,颅内压增高,脑脊液溢出到周围白质的一类脑水肿,BBB没有被破坏。缺血性脑水肿属混合性水肿。缺血区毛细血管内皮细胞及其周围的胶质 细胞即开始肿胀,持续引起血脑屏障破坏,毛细血管通透性增加,此时即由细胞毒性水肿过渡到血管源性水肿。由于胶质细胞和神经细胞受到破坏,坏死后的分解产 物又可引起缺血区渗透性增高,使脑水肿进一步加重.

现认为AQP4 水通道可能参与了创伤性颅脑损伤(TBI)后大脑血流灌注减少导致的脑水肿形成。Kiening 等研究了大鼠局灶性TBI 后脑水肿形成、AQP4 表达和皮质灌注的关系。结果发现脑水肿在24 h 达高峰,双侧大脑半球AQP4蛋白表达均降低,但伤后48 h 创伤侧大脑半球降低更明显( - 50 %) ,研究还发现,基因敲除鼠模型的脑水肿明显减轻。这表明AQP4 在改善脑组织水的调节代谢中起关键作用,提示通过抑制AQP4 可能为减轻脑水肿提供新的治疗方法。

包仕尧等研究,大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型,结果显示,脑缺血2 h后随着再灌注的开始,脑内AQP4蛋白水平迅速降低,至再灌注后12~24 h 时达最低水平,至再灌注7 d恢复到正常水平,与脑水肿程度峰值、Evans蓝最大通透率的出现时间一致,与神经功能损伤评分负相关,推测在脑缺血/再灌注损伤中AQP4水平的迅速 下降可能是机体对脑损伤所作出的一种保护性反应。Feng等的研究表明,常温下心跳骤停,大脑皮层的AQP4表达会有所上调,而低温停跳,AQP4表达会 降低。

李晓宾等研究亚低温对脑出血后水通道蛋白4 (AQP4)表达及脑水肿的影响,探讨亚低温对出血性脑水肿的作用机制。在大鼠苍白球注射胶原酶制作脑出血模型,用冰块降温及白炽灯照射加温的方法调节体 温;应用免疫组化方法检测脑组织AQP4表达,采用干湿重法观察脑含水量的动态变化。结果脑出血模型大鼠病灶侧脑含水量、血肿周围AQP4的表达水平明显 高于假手术组;各个时间点亚低温组大鼠病灶侧脑含水量以及血肿周围AQP4的表达水平均明显低于对照组; AQP4表达水平与脑含水量呈正相关。因此,亚低温能明显减轻脑出血后脑水肿及AQP4的表达,亚低温可能通过抑制AQP4的表达而减轻脑水肿。

AQP4在脑肿瘤性脑水肿中起作用, Hu等研究发现,AQP4在脑肿瘤中表达增强,增加的方式因肿瘤类型的不同而存在差异,在星形细胞瘤和神经胶质细胞瘤中心和周边AQP4的表达均显著上 调,而在肺源性转移性腺癌该表达仅出现在肿瘤周边,可能是由于腺癌中心缺乏表达AQP4的星形胶质细胞。Saadoun等报道,在高度星形胶质细胞瘤和恶 性腺瘤的活性星形胶质细胞中AQP4表达明显上调,与血脑屏障的开放显著相关,说明肿瘤内AQP4表达上调可能进一步促进水肿的形成,脑肿瘤周围胶质细胞 内的AQP4的表达水平可能决定肿瘤内的液体清除率,因此,研究肿瘤性脑水肿的分子机制有助于设计一套全新的抗脑水肿的治疗方案。

现有的研究表明,AQP4是参与脑水肿形成的重要分子,在水分子快速跨膜转运中发挥重要作用.随着分子生物学技术的发展,对AQP 水通道蛋白的研究将日益深入,它在脑水肿形成中的作用和机制将会更加明确,这对于临床工作将会有巨大的指导意义。

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